目的:对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs) Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体.方法:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET 30a Cystatin的E.coliBL21 (DE3)表达重组蛋白,经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用.利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性.结果:原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度＞95％;Azocasein法检测,0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50％以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1:512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合.结论:成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价

作者：李松；杨立彬；张舒岩；金羽；陈秀华；李新；刘玲；李树蕾；李树红

来源：吉林大学学报（医学版） 2014 年 40卷 1期