目的：构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体 Kunitz 型蛋白酶抑制剂结构域变异体（rhKD／APPvar）的毕氏酵母工程菌，建立适合大规模发酵、纯化 rhKD／APPvar的工艺。方法：利用已构建的 rhKD／APP表达质粒，在其活性中心两侧设计2个酶切位点（ApaⅠ和SacⅡ），实现人 KD／APP 活性中心 RAM 与BPTI活性中心KAR的替换，构建 rhKD／APPvar表达质粒。将重组质粒转化到酵母菌 X-33中，优化 rhKD／APPvar表达最佳 pH值，使 rhKD／APPvar获得高效表达。利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。结果：酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD／APPvar-pPICZαC重组质粒。经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌 X-33中。SDS-PAGE分析，甲醇诱导表达后在相对分子质量约6700处出现蛋白条带，pH 6.0、甲醇诱导120 h蛋白表达水平最高，经纯化获得纯度达95％的重组蛋白。结论：成功构建 KD／APPvar-pPICZαC重组质粒，经毕赤酵母表达和纯化获得了 rhKD／APPvar蛋白。
作者：王心童；王虹蛟；王强；孟威宏；颜炜群；任立群
来源：吉林大学学报（医学版） 2014 年 3期
