目的：构建microRNA－122（miR－122）的重组过表达慢病毒，并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定，为进一步研究miR－122的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中miR－122发夹前体结构RNA，并将其克隆至PCDH－CMV－MCS－EF1a－GFP－puro慢病毒表达载体上，经酶切及基因测序鉴定，将阳性重组PCDH －CMV－miR－122－EF1a －GFP－puro 表达载体、pCMV －VSV －G 和pCMV －dR8.91三质粒共转染到HEK－293T细胞，收获上清液，将所得病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK－293T细胞，并利用绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞，并利用实时定量PCR检测miR－122的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH－CMV－miR－122－EF1a－GFP－puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功，并得到滴度为3×108 TU／mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后miR－122表达明显增强。结论通过优化miRNA载体构建方法成功构建人miR－122的重组慢病毒载体并可在人类成纤维细胞内显著过表达miR－122，为miR－122的研究提供更高效稳定的基因载体。
作者：邓洁敏；邓小耿；邱荣林；伍耀豪；曾乐祥；周嘉嘉；张杰；蒋雯丽
来源：广东医学 2015 年 2期
