目的 构建人雌激素受体α亚型配体结合区(hERα-LBD)的原核表达载体,并进行表达蛋白的沽性鉴定.方法 以hERα-LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα-LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体(pGEM-T-easy)连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a(+)质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD,转化到大肠杆菌JMI09和BL21感受态细胞中.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白(BSA)偶联抗原(E2-BSA)与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性.结果 PCR扩增的hERα-LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致.与T载体连接,形成pGM-T-hERα-LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a(+)质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERαLBD蛋白.经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L.电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性.结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性.
作者：王艳芳；赵继军；田再民；郭彦峰
来源：四川大学学报（医学版） 2017 年 48卷 1期
