目的 应用谱系重编程技术将表皮角质细胞转分化为汗腺样细胞,并在体外构建三维培养体系,诱导工程化的汗腺样细胞自组装为汗腺类器官,以实现汗腺功能性修复.方法 采用CRISPR/dCas9系统上调内源性外胚层发育不全(EDA)基因在人永生化表皮角质(HaCaT)细胞中的表达,筛选阳性克隆后进行诱导培养.将细胞分为HaCaT组(HaCaT细胞使用汗腺培养基培养)、HaCaT+Dox组(HaCaT细胞使用含5μg/ml Dox的汗腺培养基培养)、HaCaT-E组(HaCaT-E细胞使用汗腺培养基培养)、HaCaT-E+Dox组(HaCaT-E细胞使用含5μg/ml Dox的汗腺培养基培养),采用RT-PCR及Western blotting检测EDA基因在各组细胞中的表达水平,以验证质粒转染是否成功.另将细胞分为HaCaT-E组(汗腺培养基组)及HaCaT-E+Dox组(汗腺培养基+5μg/ml Dox组),利用免疫荧光染色鉴定汗腺表面标记物的表达水平,以验证HaCaT细胞是否成功重编程为汗腺样细胞.随后以Matrigel为主体支架模拟汗腺发育微环境,在体外诱导汗腺样细胞自组装形成汗腺类器官,并采用免疫荧光染色检测汗腺表面标记物的表达情况.将汗腺类器官移植至裸鼠烫伤创面后,采用碘-淀粉发汗实验及组织形态学方法检测工程化的汗腺类器官参与汗腺再生及皮肤创面修复的情况.结果 CRISPR/dCas9慢病毒表达系统转染后,筛选获得Ha
作者：陈润开；付小兵；孙晓艳
来源：解放军医学杂志 2020 年 45卷 4期
