目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法.方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成cDNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性.结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好.结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-α mRNA的定量检测.
作者:姚霜;郑璐;于洋;喻妙梅;潘丽莉;张俊;冯悦华;罗光华
来源:江苏大学学报(医学版) 2015 年 25卷 6期