目的:构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat中扩增tat基因,利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ,获得正向插入克隆(pSecT at )和反向插入克隆(pSecTat-AS),经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带,与预期的324 bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×103蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT
作者:韦红玉;曾怡;唐华英;赵丽娟
来源:检验医学与临床 2014 年 11期