利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得Fv GDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-Fv GDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDEST17-FvGDH,转化大肠杆菌BL21 (DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4h.融合蛋白表达量较高,实现了FvG DH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.
作者：李磊；杨远柱；刘泓；杜长青；林建中；朱咏华；刘选明
来源：生命科学研究 2013 年 17卷 3期
