目的:研究细菌内同源重组法构建靶向Survivin的腺病毒载体及其体外扩增表达.方法:将survivin基因克隆至穿梭质粒载体中,特异性酶切后回收、连接、转化,构建负载survivin片段的重组腺病毒载体.提取重组病毒基因酶切鉴定后,包装成病毒,并扩增到所需滴度.行Western blotting鉴定,观察重组腺病毒载体在真核细胞的表达.结果:(1)重组穿梭质粒的MluI酶切鉴定结果显示,酶切结果均与相应的载体及目的片段的大小相符合,基因测序结果基本一致(2)凝胶电泳产生了两条大约15 kb和8.5kb的片段,由图2可知重组腺病毒质粒酶切充分完全,且回收率较高(3)重组腺病毒载体转染AD293细胞24 h后已出现细胞病变效应,病变细胞细胞核变大.(4)D260/OD280的值为1.92,表明重组腺病毒纯度较高(5)AD293细胞病毒上清中有能与抗Survivin单抗反应的蛋白,其相对分子质量与理论值相吻合,阴性对照组无对应条带出现.结论:本方法成功构建表达了含Sur-vivin的重组腺病毒载体,为进一步进行Survivin基因功能的研究提供了实验基础和理论支持.
作者：陈竞；高砚春；蔡燕；李金穗；郭冬梅
来源：现代生物医学进展 2016 年 16卷 17期
