重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题.此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒.若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒.以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物.故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒.两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性.该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案.
作者：肖娟；马梦琪；梁明星；贺如阳；陈华波
来源：生物工程学报 2020 年 36卷 6期
