以刀豆素A(ConA)刺激长白猪外周血单个核细胞(PBMC),提取的总RNA 为模板,采用一步法RT-PCR 扩增出包含猪γ-干扰素(PoIFN-γ)完整基因的片段.将完整的PoIFN-γ基因亚克隆到pET-32a(+)上,构建pET-IFN-γ 融合表达载体,转化入Rosetta(DE3)后IPTG 诱导表达,得到大小约为36.8 kD 的目的蛋白.将目的蛋白检测及纯化后免疫后BALB/c 小鼠,取脾细胞与SP2/0 细胞融合,最终筛选出3株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞.ELISA 叠加试验显示,3株单抗针对相同或邻近的PoIFN-γ抗原表位,制备的腹水中单抗间接ELISA 效价为1×10~4.选取单抗IF- 2株进行单抗的潜在应用研究,Western blotting 分析结果显示单抗IF- 2株能与融合表达蛋白产生特异性反应,与pET-32a(+)标签蛋白无反应;间接免疫荧光检测(IFA)发现,在采用腺病毒表达系统表达PoIFN-γ的HEK- 293 细胞中散在大量特异性荧光.
作者：娄忠子；兰喜；李建强；李学瑞；李志勇；殷相平；柳纪省
来源：生物技术通报 2010 年 1期
