目的：通过构建高尔基体膜蛋白73（GP73）氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒，研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法：根据GP73的DNA序列，设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物，以本实验室构建的野生型质粒pcDNA3-Flag-GP73为模板，构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）；用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞，用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况，用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对HepG2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果：糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白，且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失；双萤光素酶报告基因实验结果表明，野生型GP73能够激活HepG2细胞中NF-κB的转录活性，而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论：构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pcDNA3-Flag-GP73（DM）。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路，糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。
作者：葛晓幸；钟辉；杨晓莉
来源：生物技术通讯 2015 年 2期
