[目的]鉴定与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质蛋白(matrix protein,M)入核相关的细胞蛋白,以阐明NDV M蛋白细胞核定位的分子机制.[方法]从鸡胚成纤维细胞中分别克隆核转运受体蛋白KPNA 1-KPNA6和KPNB1基因,将其构建到真核表达载体,并与表达NDV M蛋白的重组真核表达载体分别共转染HEK-293T细胞,通过免疫共沉淀方法鉴定与NDV M蛋白相互作用的核转运受体蛋白.另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体或与M蛋白互作的核转运受体蛋白缺失体分别共表达,通过荧光共定位确定M蛋白入核转运相关的细胞蛋白.[结果]构建的重组真核表达载体在HEK-293T细胞中能够正确表达;通过间接免疫荧光观察发现,重组蛋白中除Myc-KPNA2蛋白定位在细胞质外,其它核转运受体蛋白均与M蛋白表现出相同的细胞核定位.免疫共沉淀试验结果表明,M蛋白与KPNA1蛋白和KPNB1蛋白均存在相互作用.进一步通过荧光共定位观察发现,M蛋白与KPNA1蛋白缺失体(DN-KPNA1)共表达不改变M蛋白的细胞核定位,而与KPNB 1蛋白缺失体(DN-KPNB 1)共表达后导致M蛋白变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运需要KPNB1蛋白的参与.另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体Ran-Q69L共表达,荧光观察发现M蛋白同样由细胞核定位变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运还需要Ran蛋白的辅助.[结论]KPN
作者：段志强；嵇辛勤；许厚强；赵佳福；许海旭；胡顺林；刘秀梵
来源：微生物学报 2017 年 57卷 1期
