[目的]构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋白或辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用.[方法]利用全基因合成和分子生物学相结合的方法,在获得可分别表达EGFP和无生物活性蛋白的单顺反子微型基因组质粒pUC57-RSV-EGFP和pUC57-RSV-ORF1的基础上,进一步克隆至pBR322B载体,获得编码EGFP及无生物活性蛋白的双顺反子微型基因组质粒,经限制性内切酶和核酸序列分析正确后,与可表达4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达以及RT-qPCR对EGFP mRNA的转录水平进行定量分析.[结果]成功构建了编码EGFP和无生物活性蛋白的RSV双顺反子微型基因组质粒pBR322B-RSV Ⅱ-EGFP,经与编码4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,发现4种辅助蛋白对EGFP的表达具有不同的功能活性.[结论]以可表达EGFP报告基因的RSV双顺反子微型基因组重组质粒,实现了对4种辅助蛋白的功能验证,其中M2-1蛋白在双顺反子微型基因组拯救过程中具有转录延长的生物学活性.
作者：郑元博；张秀娟；许敏；姜男；彭向雷；付远辉；郑妍鹏；洪涛；何金生
来源：微生物学报 2017 年 57卷 7期
