[目的]通过计算机辅助设计,理性提高羊布鲁氏菌7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性,实现酶的高效稳定催化合成.[方法]通过同源建模、分子对接和蛋白-配体相互作用分析,理性设计关键位点的定向突变.结合酶学性质测定、酶促反应动力学分析和圆二色谱测定等实验,测定突变酶的催化功能和稳定性.[结果]与野生型7α-羟基类固醇脱氢酶相比,Met196I1e和Met196Val突变酶的酶活提高了 8.33倍和7.41倍,kcat/Km值分别提高了 4.93和4.37倍,Tm值分别提高了 1.75℃和1.10℃.Met19611e和Met196Val突变酶催化底物鹅去氧胆酸,合成产物7-氧代-石胆酸所需时间从野生型的8 h缩短为2 h,最高产率约为91％.通过全原子动力学模拟分析了均方根偏差、均方根波动以及蛋白-配体相互作用,阐明了催化性能提高的分子机制.Met196突变诱导的B环(残基Ala145-Pro 157)和α7螺旋(残基Val249-Gly265)的刚性增强有利于提高蛋白的稳定性,底物与结合位点或活性位点(Tyr208、Lys212)相互作用力的增强有利于改善催化效率.[结论]本研究采用同源建模和定点突变改造7α-羟基类固醇脱氢酶的催化活力和稳定性,为工业上高效稳定催化合成7-氧代-石胆酸奠定了较坚实的基础,同时为类固醇脱氢酶的理性设计提供了理论指导.
作者：柳志永；张荣珍；徐岩
来源：微生物学报 2022 年 62卷 5期
