背景：研究表明，神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子，因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰，有可能将成体细胞转分化为神经细胞，为视神经再生治疗提供新策略。目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体，获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP，以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。方法：用 XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切；回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化至 DH5α感受态；提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体， PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染 HEK293细胞进行包装、扩增，采用 PCR 法对重组腺病毒进行鉴定， TCID50法测定病毒滴度，荧光显微镜观察病毒感染效率。结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定，证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确，PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带，TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80
作者：袁静；葛坚；俞建雄
来源：中国组织工程研究 2015 年 41期
