背景：抑制椎间盘细胞外基质的降解可以延缓椎间盘退变的进程，基质金属蛋白酶3是降解Ⅱ型胶原和蛋白多糖细胞外基质成分的关键酶。<br> 目的：构建人基质金属蛋白酶3特异性shRNA 重组慢病毒载体，感染人退变的髓核细胞，鉴定干扰效果。<br> 方法：根据基质金属蛋白酶3基因mRNA序列，设计4组靶向基质金属蛋白酶3基因的短发夹RNA序列，合成、退火形成双链DNA片段，与经过DNA内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞，对长出的克隆进行菌落 PCR 鉴定，并对阳性克隆进行测序及比对分析。通过转染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。用慢病毒质粒载体感染人退变的髓核细胞，荧光显微镜观察感染率，在72和96 h使用实时PCR和Western blot检测干扰效果。<br> 结果与结论：①酶切和测序两种方法结果证明4种质粒载体的插入序列完全正确，慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为(1-5)×108TU/mL。②含有GCC AGG CTT TCC CAA GCA AAT干扰序列的干扰效率最高，72和96 h基质金属蛋白酶3基因表达水平干扰分别为98
作者：曹进；傅培荣；房晶；杨建坤；位华卫；李思源；高峰；西永明
来源：中国组织工程研究 2016 年 20卷 7期
