目的:构建人载脂蛋白AV(apolipoprotein AV,apoAV)的原核载体并表达纯化该蛋白.方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,以反转录的cDNA第一链为模板,经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到含有编码apoAV完整成熟肽段的PCR片段.PCR产物和原核表达载体pET30b经核酸内切酶双切后连接,连接产物经转化至大肠杆菌感受态细胞Top10,挑选克隆测序.重组质粒pET30b-apoAV转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化诱导表达条件,重组的apoAV经镍离子螯合树脂纯化获得.结果:经测序证实人apoAV目的基因成功克隆入pET30b原核表达载体中,经过IPTG诱导有约40KD的特异性蛋白表达,与预期大小一致.该蛋白在IPTG诱导下的最佳表达时间为5h,最佳浓度在31.3 μmol/L.纯化的apoAV纯度在95％以上,产率约为15 mg/L.结论:成功构建人apoAV的原核表达载体,实现了高效表达和纯化,为进一步研究其结构与功能奠定了基础.
作者：李国平；隋靖喆；毕楠；满永；王抒；陈保生；黎健
来源：心肺血管病杂志 2013 年 32卷 4期
