随着功能基因组学研究的深入发展，基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养，是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统，但基因敲除成功率不十分理想。这些遗传操作方法基于 pyrE 筛选标记，利用携带同源片段的环状质粒与基因组同源片段间的两次同源重组，敲除目的基因。由于基于环状质粒和 pyrE 筛选标记的经典同源重组敲除方法在二次重组时，普遍存在回复到野生型菌株的可能，导致二次重组子中敲除目的基因的阳性菌株比例较低。为了克服传统同源重组技术的上述缺陷，文章建立了基于线性 DNA片段的同源重组技术。该方法通过一次重组在目标基因的下游引入一段上游同源片段和 pyrE 标记，从而限定二次重组的发生部位只能在两段上游同源片段之间，发生二次重组的重组子理论上都敲除了目标基因。利用该方法，文章成功敲除了嗜盐古菌Haloferax volcanii的xpd2基因，阳性克隆率达65
作者：王小利；姜闯；刘建华；刘喜朋
来源：遗传 2015 年 4期
