目的：有研究显示EphB4表达异常在结肠癌发生发展中具有重要意义。文中通过构建慢病毒介导稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株，以期为结肠癌的基因治疗提供一定的实验依据。方法通过PCR反应将人工合成的EphB4基因序列装入pcDNA3．1（＋）载体，并通过测序验证重组克隆插入片段的序列信息。将质粒中扩增的目的基因片断克隆装入慢病毒表达载体pLenti6．3-MCS-IRES2-EGFP并进行基因测序以确认慢病毒载体是否成功构建。携带EphB4和EGFP基因的慢病毒通过阳离子脂质体转染293 T细胞，收集富含EphB4基因的病毒颗粒上清液，梯度稀释后测定病毒滴度并感染人结肠癌细胞株SW480和Coca-2，通过药物筛选及维持构建稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株。荧光显微镜下观察各组细胞中绿色荧光蛋白（ green fluorescence protein ， GFP）表达情况，qPCR检测转染前后各组细胞中靶基因EphB4 mRNA，评价过表达效果。结果含有2964 bp人EphB4基因编码区的慢病毒载体pLenti6．3-EphB4-IRES2-EGFP构建成功，基因测序结果完全正确，经慢病毒包装所得病毒上清液Lenti6．3-EphB4滴度为1×108 TU/mL。稳转细胞株在荧光显微镜下可见GFP表达，qPCR实验证明转染后SW480及Coca-2细胞中EphB4 mRNA表达水平较转染前明显增加。结论成功扩增
作者：张锦；夏秋媛；王建东；周晓军
来源：医学研究生学报 2014 年 9期
