目的:树突状细胞相关C型凝集素-1( dendritic cell-associated C-type lectin-1, Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段 CLEC7A-pIRES2-EGFP 重组到中间载体 pDONR221上,再与腺病毒骨架质粒 pAD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293( HEK293)细胞,收获重组腺病毒pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组( Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011 IU/mL,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。
作者:夏迪;钱倩;刘志成;谭鸣鸣;丁媛;苏欣;孙文逵;施毅
来源:医学研究生学报 2015 年 4期