目的 建立一种基于COS-7细胞的细胞色素P450 2C9(CYP2C9)体外酶学活性检测的新方法.方法 以野生型CYP2C9*1基因的全长cDNA为模板,通过定点诱变方法获得突变型CYP2C9*2、*3及*13的cDNA全长,分别与分泌型荧光素酶Gluc内参基因一起导人pIRES载体的A、B多克隆位点,构建成双表达载体pIRES-Gluc-CYP2C9.利用Lipofectamine 2000瞬时转染COS-7细胞,48h后弃培养基,加入含100μmol/L Luciferin-H荧光底物的新鲜培养基,继续培养8h后利用Promega CYP2C9活性试剂盒及NEB Gluc检测试剂盒分别检测CYP2C9各型及内参Gluc的活性,用Western blot检测两种蛋白的表达量.结果 本研究成功构建了pIRES-Gluc-CYP2C9*1及其突变体*2、*3、*13的表达载体,通过检测CYP2C9特异性荧光素底物Luciferin-H的分解产物的荧光信号与分泌型荧光素酶Gluc的内参荧光信号的比值作为CYP2C9的体外酶学活性值,研究结果显示突变体CYP2C9 *2、*3、*13的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9*1的43.12％、8.15％和1.49％.结论 本研究成功建立了一种基于COS-7细胞的CYP2C9体外酶学活性检测的新方法,该方法操作简便、实验周期短,适于新突变体CYP2C9的快速活性检测及其代谢新药物或抑制剂的相关性研究.
作者：王双虎；戴大鹏；胡利明；耿培武；蔡剑平；胡国新
来源：医学研究杂志 2013 年 42卷 2期
