目的 构建含有RagB的重组慢病毒表达载体,实现RagB基因在C2C12细胞中过表达,并检测熊果酸对该细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性的调节作用.方法 使用Flag pLJM1 RagBWr、Flag pLJM1RagB54L和Flag pLJM1 RagB99L慢病毒载体作为模板,PCR扩增Flag-RagBWT、Flag-RagB54L和Flag-RagB99L,然后将其亚克隆到pWPI载体的SwaI酶切位点之中,进行茵液PCR鉴定;将克隆好的pWPI-RagBWr、pWPI-RagB54L和pWPI-RagB99L质粒和病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G按相应的比例转染到293T细胞中,48 h后收集上清液感染C2C12细胞,实现RagB基因在C2C12细胞中过表达;使用亮氨酸和熊果酸单独或共同处理RagB99L过表达的C2C12细胞,Western blot检测mTOR活性.结果 使用上清液感染C2C12细胞,荧光显微镜显示感染效率接近100％,Western blot证实RagB蛋白表达明显增高;熊果酸显著抑制RagB99L过表达细胞中mTOR活性.结论 通过构建慢病毒载体实现RagB基因在C2C12细胞中过表达,RagB在熊果酸抑制mTOR活性中具有关键作用.
作者：欧翔；周志姣；皮银珍
来源：中国动脉硬化杂志 2016 年 24卷 7期
