目的 构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株.方法 设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA(sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sgTgmif质粒.构建含有Tgmif上游1 001 bp(Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1 011 bp(Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA.将pSAG1::Cas9-U6::sgTgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RHWT)速殖子,用乙胺嘧啶培养7d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RHΔTgmif).提取RHΔTgmif和RHWT株虫体蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析TgMIF蛋白的表达情况.RHΔTgmif在人包皮成纤维(HFF)细胞中传代10代,吉氏染色,镜检计数100个HFF中速殖子数,评估RHΔTgmif 在体外培养HFF细胞中的增殖能力,以RHWT为对照.将20只BABL/c小鼠随机分为RHWT组和RHΔTgmif 组(10只/组),各组分别腹腔注射RHWT或RHΔTgmif 株速殖子(1 000个/鼠),记录小鼠生存情况.弓形虫增殖能力的比较采用独立样本t检验,小鼠生存率的比较采用Log Rank

作者：王杰；温红阳；陈滢；安然；罗庆礼；沈继龙；都建

来源：中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022 年 40卷 3期