目的:构建单链免疫毒素hscFv-ETA'的原核表达载体,经表达后鉴定其对CML细胞的特异性杀伤作用.方法:采用亚克隆技术,首先将hscFv与截短的假单胞菌外毒素基因ETA'通过酶切及连接反应,在载体pWW20上构建hscFv-ETA'单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体中,转化BL21(DH3)宿主菌,IPTG诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法,Western blot鉴定纯化的目的蛋白,FCM鉴定融合蛋白hscFv-ETA'与细胞结合的活性以及诱导细胞凋亡的能力.结果:限制性酶切图谱和序列分析证实,在pET32a(+)原核表达载体上成功地构建了hscFv-ETA'单链免疫毒素载体;该基因在pET32a(+)载体中获得高效表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符;经Western blot鉴定证实纯化后的重组免疫毒素hscFv-ETA'融合蛋白是正确的;经FCM证实hscFv-ETA'蛋白能特异性结合CML细胞并诱导细胞凋亡.结论:已成功构建并原核表达单链免疫毒素hscFv-ETA',证明该蛋白能发挥特异性结合并诱导CML细胞凋亡.
作者：朱小影；陶崑；李身锋；张利军；李亚娟；王东；钟梁；冯文莉
来源：中国免疫学杂志 2013 年 29卷 12期
