目的：利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白（ EGFP）。方法：PCR方式扩增EGFP基因片段，重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体 pdi-Avitag，构建原核表达载体pEGFP-（Avitag）2并转化E.coli DH5α；表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-（ Avitag）2，以BirA酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接，并以 Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果：成功构建pEGFP-（Avitag）2载体，并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-（Avitag）2，经Western blot和竞争ELISA鉴定， EGFP-（ Avitag）2分子经BirA酶体外催化可连接两个生物素分子。结论：成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白，为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。
作者：赵爽佳；鲍如梦；唐海科；包雪翠；杨洪鸣；唐金宝
来源：中国免疫学杂志 2015 年 5期
