目的 建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法,为其实验室诊断与定量分析提供技术方法.方法 基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析,筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列,并以人GAPDH基因为内参照,设计引物、探针,采用L9(34)正交实验确定最佳反应条件,建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRT-PCR快检方法,并详细分析所建立方法的灵敏度、特异度、重复性及覆盖面.以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品,制作标准曲线,建立绝对定量方法.结果 经系统优化,建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR定性、定量检测方法,反应体系包括:基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针,RT/Taq酶混合液,反应缓冲液及阴阳性参考品.所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株,亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果,而与所试其他18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应,检测下限为580拷贝/mL.定量分析表明,在5.80×102～5.80×1010拷贝/mL范围内,检测荧光信号值与模板浓度具备良好线性关系,其R2=0.999 5,扩增效率为E=0.91％.重复性实验表明,定量分析的批内变异系数为0.01～0.07,批间变异系数为0.03～0.11.结论 建立了基孔肯雅病毒的实时荧光定量RT-PCR定性、定量快检方法,
作者：李春缘；刘炅；刘纪茹；胡潇予；曹孟涛；陈月；田靖；任瑞文；徐晓立
来源：中国热带医学 2023 年 23卷 2期
