目的 建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法.方法 从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leukocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoR Ⅰ酶切及测序鉴定；优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性.结果 重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确；建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1；该方法的敏感性可达101 copies/μl；融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好；质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5％.结论 已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础.
作者：金元昌；李玉峰；袁志栋
来源：中国生物制品学杂志 2013 年 26卷 2期
