目的 原核表达艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH),纯化重组蛋白,并检测其酶活性.方法 采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性.结果 重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达.纯化的目的蛋白纯度可达90％,浓度为1.7 mg/ml.纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L.结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础.
作者：杜茜；吴志鹃；蔡雪飞；袁作为；张君；郑建
来源：中国生物制品学杂志 2013 年 26卷 7期
