目的 在大肠埃希菌中融合表达绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A,PEA)受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65),并进行纯化.方法 从含PEA的质粒中扩增PEA受体结合区亚基PEA Ⅰ,克隆至pET-28a-HSP65质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-HSP65-PEA Ⅰ,转化大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析;利用抗PEA受体结合区单抗杂交瘤细胞制备抗PEA受体结合亚基单抗,偶联免疫亲和层析介质,将表达的重组蛋白经DEAE Sepharose 4FF阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和免疫亲和层析进行纯化.结果 重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达的重组HSP65-PEA Ⅰ蛋白相对分子质量约93 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30％以上;抗PEA受体结合亚基单抗效价可达1∶10000.纯化的重组HSP65-PEA Ⅰ蛋白纯度达90％以上.结论 已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组融合蛋白HSP65-PEA Ⅰ,为防止PA感染后多器官衰竭综合征的免疫制剂的研究奠定了基础.
作者：冯越；张国利；赵福广；万忠海；岳玉环；吴广谋；田园；刘雪；张亮
来源：中国生物制品学杂志 2013 年 26卷 10期
