目的:寻找内毒素耐受(ET)的潜在关键基因,为脓毒症的治疗提供理论和实验依据。方法:①实验1(基因芯片与生物信息分析):从基因表达数据库(GEO)中下载ET相关基因数据集GSE47783,该数据集由脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞建立脓毒症模型(LPS组)和ET模型(ET组)后进行实验获得;利用IDEP 0.92软件筛选数据集中两组差异表达基因(DEG),同时进行基因本体(GO)分析,并定位DEG主要富集的功能和信号通路。利用基因与蛋白质相互作用检索数据库(STRING),针对DEG构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,筛选出核心基因甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2(HAVCR2)进行后续验证研究。②实验2(小鼠巨噬细胞株RAW264.7模型制备):体外培养RAW264.7细胞,通过LPS刺激制备ET模型(ET组,用10 μg/L的LPS培养24 h后,再用100 μg/L的LPS培养4 h)和脓毒症模型(LPS组,用100 μg/L的LPS培养4 h);磷酸盐缓冲液(PBS)组给予等体积溶媒PBS培养4 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测细胞HAVCR2的mRNA及蛋白表达。③实验3(HAVCR2慢病毒载体转染RAW264.7细胞):为进一步明确HAVCR2是否参与ET形成,用慢病毒短发夹RNA(shRNA)技术敲低RAW264.7细胞中的
作者:刘垚;刘逸;张小禾;陈睦虎;胡迎春
来源:中华危重病急救医学 2021 年 33卷 4期