目的 研究红色荧光蛋白编码基因 Dsred 在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达.方法 根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠 PCR方法 快速克隆获得全长 Dsred 基因,将其与 pMD-18T 载体连接后进行测序鉴定.通过 In-fusion 方法 将鉴定正确的pMD-Dsred 重组载体与酿酒酵母表达载体 pYeDP60 进行连接,测序后利用 LiAc 方法 将鉴定正确的 pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 中,PCR 扩增筛选阳性克隆,获得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经诱导培养后进行 SDS-PAGE 电泳分析和绿光激发荧光成像检测.将工程菌分别接种至 YPD、YPG、SCG 和 SCD 培养基,培养 48、72、96、120 和 144 h 后分别测定吸光度(A600)值.取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于 -70、-20、4、28 和 37 ℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性.结果 连续重叠 PCR 扩增和测序鉴定结果 表明,扩增获得的 Dsred 基因长为 678 bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重组表达载体,且受酵母诱导型启动子 GAL10-CYC1 调控表达.PCR扩增筛选和 SDS-PAGE 分析显示,pYeDP60-Dsred 重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,

作者：史彦薇；王志芳；王伟；安建梅；孔建强

来源：中国医药生物技术 2012 年 07卷 2期