目的构建核干细胞因子基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒表达载体并对其在白血病细胞株中的干扰效果进行鉴定，为后期研究奠定基础。方法针对核干细胞因子基因的序列设计RNAi有效靶点，合成含RNA干扰序列、Loop环、AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，以及终止信号的单链DNA oligo，经退火形成双链DNA，与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体，转化感受态细菌，挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应，并对PCR阳性克隆进行测序。将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293 T细胞进行病毒的包装，收集、浓缩病毒液后测定其滴度，并转染HL-60、NB4以及K562等三种人白血病细胞株，倒置荧光显微镜下观察其转染效率，real-time PCR检测核干细胞因子基因的敲减效率。结果经测序证实正确构建出了核干细胞因子基因的RNAi重组慢病毒载体，包装、浓缩后其滴度为4×108 TU/ml，荧光显微镜下显示其能有效转染进入HL-60、NB4及K562等白血病细胞株中，转染效率均在80％以上；real-time PCR显示转染后核干细胞因子基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降（ P＜0.05），在HL-60、NB4和K562细胞中核干细胞因子基因的抑制效率分
作者：孙晓莉；Abdallah Dlykan；贾宇；魏园玉；刘帅；岳保红
来源：中华临床医师杂志（电子版） 2013 年 11期
