目的 构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒表达载体.方法 以pUC-SRα/HGF载体为模板,利用PCR体系扩增获得两端带有attB重组位点的HGF基因编码序列,并通过BP反应将其克隆至入门载体pDONRTM221的多克隆位点内以构建入门载体pDown-HGF.通过LR反应将pDown-HGF、pUp-EF1α、pTail-IRES/EGFP与目的载体pLV.Des3d.P/neo连接,得到慢病毒表达载体pLVneo/EF1 α-HGF-IRES-EGFP.并进行PCR鉴定和DNA测序.随后,通过脂质体将该重组载体与慢病毒包装系统共转染293FT细胞,空斑法测定病毒滴度.结果 PCR及DNA测序结果证实pLVneo/EF1α-HGF-IRES-EGFP中HGF基因目的片段插入位置和序列正确.转染pLVneo/EF1 α-HGF-IRES-EGFP后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.包装的慢病毒液滴度为7.9×107 TU/ml.结论 成功构建了携带EGFP基因的人HGF基因慢病毒表达载体.
作者：雷立华；林群；郑辉哲；林财珠；林健清；林献忠；蔡宏达；杨庆；高友光
来源：中华麻醉学杂志 2014 年 34卷 5期
