目的分析泛素依赖的蛋白水解通路(UPP)在转染了脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)基因的PC12细胞中的定位及作用.方法构建含有SCA3正常与突变基因在内的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFPC1-ataxin3 Q28、pEGFPC1-ataxin3 Q84)后转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞,转染后24、72、120 h免疫荧光检测ataxin3、泛素(ubiquitin)、蛋白水解酶核心成分20S及热休克蛋白40、70(Hsp40、Hsp70)在细胞内的分布情况,观察其与核内包涵体(INIs)共定位的情况;给予蛋白水解酶抑制剂lactacystin (10 μmol/L)后台盼蓝染色观察细胞存活率的变化.结果正常蛋白ataxin3 Q28于胞质、胞核广泛分布,而突变蛋白ataxin3 Q84多集中于胞核内;ubiquitin在两组的表现与目的蛋白一致.随着时间的延长20S及Hsp40、Hsp70细胞核内与INIs共定位,形成密集荧光.正常对照组与突变组120 h时INIs形成数目在Hsp40组分别为18.40±3.36、75.00±5.09;Hsp70组分别为15.43±3.05、74.75±4.99;20S组分别为4.20±1.92、92.61±3.65,统计学处理正常对照组与突变组之间P值分别为0.000、0.043、0.027,差异有统计学意义;突变组给予lactacystin后细胞死亡明显增加,前后对比120 h时细胞死亡数目分别为77.50±3.33、94.67±1.82,统计学处理前后组之间P值为0.000
作者:谢秋幼;梁秀龄;李洵桦;徐琳;陈曦;汤其强
来源:中华神经科杂志 2005 年 38卷 11期