目的：构建肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因（crp基因）缺失突变株与回补株，了解crp基因在肺炎克雷伯菌生物膜形成中的作用。方法设计位于crp基因（566 bp）上游698 bp片段及下游576 bp片段的两对引物，分别扩增出相应片段并通过融合PCR构建一个1274 bp片段的突变盒，利用双酶切克隆的方法将突变盒克隆至温度敏感性自杀载体pKO3-Km的NotⅠ位点间，电转化至肺炎克雷伯菌中构建肺炎克雷伯菌crp基因无痕缺失突变株（Δcrp）。扩增包含crp基因编码、启动子结合区及转录终止区的2063 bp基因片段并克隆至pGEM-T-easy质粒上，将此质粒电转至crp基因缺失突变株中构建crp基因回补株（C-crp）。采用RT-PCR方法检测crp基因在基因缺失株与回补株的表达情况，确定crp基因缺失突变株与回补株构建成功。利用结晶紫染色法检测crp基因对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响，并通过酵母凝集试验检测crp基因对肺炎克雷伯菌的菌毛形成影响。结果成功构建了肺炎克雷伯菌crp基因缺失突变株与回补株，RT-PCR结果显示，crp基因在缺失突变株中无表达，在回补株重新表达。体外试管静止培养48 h后，crp基因缺失株无明显生物膜形成，而在野生株及回补株的液体培养基表面形成宽厚生物膜。结晶紫染色定量发现，crp缺失突变株的生物膜相对形成
作者：雷旭；谭华炳
来源：中华实验和临床感染病杂志（电子版） 2014 年 2期
