目的 获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中核因子[NF-κB(p65)]表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3 3条针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5'向3'顺序依次为:酶切位点(BamH Ⅰ)、干扰序列(19bp)、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19 bp)、中止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR Ⅰ).将合成的序列插入空载体pSI H1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time聚合酶链反应(PCR)检测不同序列片段对p65的mRNA抑制效果,通过Western blot检测对p65蛋白表达的抑制效果.从而获得可以稳定高效抑制前列腺癌细胞中p65表达的shRNA序列.结果 设计的3条针对p65的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于p65(NM_021975)的1096~1113,茎环序列为5'-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTTTT G-3'.其对前列腺癌细胞株中p65的mRNA的干扰效率为59
作者:郭正辉;黄海;杜涛;林天歆;李海源;许可慰;宁志丰;江春;韩金利;黄健
来源:中华实验外科杂志 2010 年 27卷 9期