目的 构建Bag-1短发卡RNA(shRNA)干扰载体并通过内源性筛靶实验检测Bag-1基因mRNA和蛋白的表达,筛选出最佳的干扰靶序列.方法 应用干扰技术构建Bag-1 shRNA干扰载体,在细胞转染预实验中将构建好的带有绿色荧光蛋白的质粒转染Lovo细胞,通过观察绿色荧光蛋白来判断转染的效率,分别应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测Bag-1在LoVo细胞中的表达.在shRNA干扰序列筛选实验中,通过定量PCR和Western blot法来检测构建的干扰载体在LoVo细胞中的表达.结果 重组质粒分别经双酶切分析,琼脂糖凝胶电泳鉴定可见清晰地切出与Bag-1及pGPHl/GFP/Neo载体大小相符的片段并与DNA Marker相符.用带绿色荧光基因的pGPH1/GFP/Neo-shNC质粒转染LoVo细胞,在转染后的第24、48及72小时分别观察到逐渐增强的绿色荧光蛋白的表达.分别应用RT-PCR和Western blot法检测Bag-1在LoVo细胞中的表达,可见Bag-1在LoVo细胞中的mRNA和蛋白表达水平均较高.在Bag-1有效shRNA干扰序列筛选实验中,综合定量PCR及Western blot内源筛靶结果,筛选出Bag-1-homo-825作为最佳干扰靶序列.结论 成功构建针对小鼠Bag-1基因的特异性shRNA质粒,获得稳定转染的结肠癌Lovo细胞株,结果证明所构建的pGPH1/GFP/Neo-Bag-1-homo-825作为最佳干扰靶序列,显

作者：孙念峰；田爱玲；徐伯栋；田玉玲；胡三元

来源：中华实验外科杂志 2012 年 29卷 12期