目的 建立入骨骼肌成肌细胞分离和纯化方法,展示人成肌细胞体外增殖分化至衰老的全过程；研究INK4a信号通路对其衰老的诱导.方法 采用机械法和胶原酶消化法,结合差速贴壁技术,获得高纯度的人成肌细胞,结蛋白(desmin)抗体染色鉴定,β-半乳糖苷酶染色及倒置显微镜下观察人成肌细胞生长、分化及衰老全程.构建慢病毒载体pLVX-p16INK4a,感染第3代入骨骼肌成肌细胞(p16组),采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定p16INK4amRNA水平,Western blot法测定蛋白水平；用β-半乳糖苷酶染色及倒置显微镜下观察鉴定细胞衰老程度.结果 desmin抗体着色表明分离得到的人成肌细胞纯度接近100％,获取了其增殖并分化为肌管、肌纤维以及最终转归为衰老细胞各阶段的实验图片.转染7d后,RT-qPCR法与Western blot法证明p16组细胞p16INK4a mRNA与蛋白表达水平明显高于对照组(P＜0.05);p16组细胞镜下见明显衰老表型,细胞计数显著少于对照组(P＜0.05),胞质经β-半乳糖苷酶染色后有明显蓝染,而对照组胞质蓝染微弱.结论 人成肌细胞体外分离培养获得的不同阶段实验图景与现象分析,为以其为靶点的研究奠定了基础.INK4a信号通路的上调直接诱导了人成肌细胞的衰老.
作者：赵丽霞；李蓉；熊东林；姚尚龙；廖翔
来源：中华实验外科杂志 2013 年 30卷 7期
