目的 构建并鉴定携带大鼠线粒体融合蛋白(rMfn2)基因的重组腺病毒AdS-mCMV-增强绿色荧光蛋白(EGFP)-CMV-rMfn2表达载体.方法 设计含有Not Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,应用聚合酶链反应(PCR)法扩增目的基因rMfn2,将扩增产物连接到穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-CMV-rMfn2.测序鉴定重组穿梭质粒后,与腺病毒骨架质粒pAd5在JM109感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒AD-rMfn2,而后感染HEK293细胞进行包装、扩增、纯化,并测定病毒滴度;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测目的基因rMfn2在HEK293细胞中的转录及表达.结果 腺病毒穿梭质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,目的基因rMfn2正确克隆至腺病毒骨架质粒中;在HEK293细胞中包装、扩增获得了高滴度的重组腺病毒AD-rMfn2,其滴度为4×1013 TU/L;AD-rMfn2感染HEK293细胞48 h后,可检测到目的基因rMfn2的转录和蛋白表达.结论 成功构建重组腺病毒AD-rMfn2.
作者：李文滨；林泽宇；陈亚进；龙天柱；万云乐；贾长库
来源：中华实验外科杂志 2014 年 31卷 2期
