目的 利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术将293T细胞中的Ku80基因敲除,建立Ku80敲除的293T细胞株,并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响.方法 首先,设计识别针对靶位点的1对DNAOligos,利用pSpCas9 (BB)-2A-Puro (PX459)质粒构建表达导向RNA (sgRNA)载体.载体转染293T细胞.通过定点聚合酶链式反应(PCR)和T7E1内切酶酶切鉴定,确认所设计的sgRNA的有效性.进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选,挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株.最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变.使用阿霉素处理诱导DNA损伤,以磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)为指标检测DNA损伤,同时用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性.结果 成功构建Ku80基因敲除的293T细胞,用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后,对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为(30.67±2.49)％和(88.00±1.63)％ (P=0.000),表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制.同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性,阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为(53.99±1.29)％和(32.42±1.20)％(P=0.0

作者：赖永平；曾金华；谭雄红；柯坤；赵必星

来源：中华实验外科杂志 2018 年 35卷 8期