目的建立Fas相关死亡域(FADD)缺失突变体的表达细胞系,阻断Fas死亡信号传导,以便今后更深入的探讨通过基因水平修饰靶细胞,改变靶细胞的反应状态,对移植免疫和自身免疫性疾病的可能的影响. 方法用RT-PCR从感染患者外周血淋巴细胞中获得缺失FADD死亡域目的基因片段(FADDdel),利用双酶切将FADDdel定向导入真核表达载体pUC-pIC;用电穿孔法将重组子导入人β胰岛细胞株(NIT)中,采用FACS法检测sFasL所引起的转染前后NIT凋亡情况.同时在Internet中通过计算机数字化分子模型技术,成功模建FADDdel的3D结构并与FADD的立体结构进行比较与分析. 结果 RT-PCR法得到约500bp的目的基因片段,转化子用BglⅡ,XbaⅠ酶切后得到3个特异性片段,经酶切和测序鉴定为FADD缺失突变的重组体(pFADDdel).将pFADDdel导入NIT后,筛选出高表达细胞系F15,在IFN-γ和TNF-α存在时F15仍能有效拮抗sFasL诱导的凋亡;并对FADD和FADDdel功能结合域和结合位点分析,阐明了FADDdel蛋白质分子在阻断细胞凋亡胞内信号传导通路的分子机制. 结论成功建立了FADDdel稳定表达的人胰岛细胞株;pFADDdel能有效抑制Fas和TNFR1介导的胞内凋亡信号通路;为进一步研究移植免疫和器官特异性自身免疫性疾病的发生机制提供了理论依据.
作者：周华蓉；李鸣；张悦；周新荣；沈关心
来源：中华微生物学和免疫学杂志 2001 年 21卷 6期
