目的 采用一种快速高效的体外重组法制备表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组人14型腺病毒载体rAd14-EGFP.方法 BJ5183菌内同源重组构建人腺病毒14型骨架质粒pBRAd14,线性化后转染AD293细胞拯救病毒.利用Exnase重组酶在体外同时进行4个片段同源重组,同源序列长为15～20 bp,可一次性把3个PCR制备的外源Ad14 E3L、Ad14 E3R和EGFP基因片段克隆至质粒pBluescriptⅡSK(-)中,得到穿梭质粒pSK14-EGFP.以pSK14-EGFP为模板进行PCR扩增制备Ad14 E3L-EGFP-Ad14 E3R片段,质粒pBRAd14进行双酶切并回收27 kb大片段,利用Exnase重组酶进行同源重组,制备重组质粒pBRAd14-EGFP,线性化后转染细胞获得E3区缺失并表达EGFP的病毒载体rAd14-EGFP,用其免疫小鼠并检测免疫应答.结果 成功制备E3区缺失的表达EGFP的复制型腺病毒载体rAd14-EGFP,其细胞内复制特性、免疫原性与Ad14没有显著差异.结论 利用商品化的Exnase同源重组酶的体外重组法可用于快速、高效、正确地构建腺病毒载体.
作者：陈咏；田新贵；周荣
来源：中华微生物学和免疫学杂志 2019 年 39卷 9期
