目的 探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮(RPE)细胞层和光感受器(PR)细胞层的可行性.方法 147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根据电穿孔刺激模式电压值分为5、10、15、20、25、30、35 V组,右眼视网膜下腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达质粒pEGFP-N1为实验眼,左眼注射TE Buffer为对照眼.各组根据不同转染方向再分为RPE和PR两个亚组.各组除电压不同外,其余参数均为脉宽99 ms,脉冲间期0.5 s,连续5个脉冲.将带有负电荷的质粒在电场作用下,拟转染到RPE细胞层,反向置电极,拟转染到PR细胞层.转染后7 d取各组视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围及荧光细胞计数分析;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达.结果 转染后7 d,荧光显微镜观察发现,各组RPE亚组对照眼RPE细胞层内均未见特异性荧光表达,实验眼可见绿色荧光表达;各组RPE亚组对照眼视网膜铺片均未见荧光表达,实验眼视网膜铺片均可见转染了EGFP的RPE细胞.Western blot检测显示,随电压增加,EGFP蛋白与β-肌动蛋白条带灰度相对比值呈上升趋势.RT-PCR检测显示,各组均产生阳性扩增条带,随电压增高,EGFP mRNA与GADPH mRNA扩增条带灰度相对比值逐渐增高.结论 在体电穿孔
作者：张萌；莫晓芬；郭文毅；吴继红；方媛；张圣海；李希
来源：中华眼底病杂志 2010 年 26卷 1期
