目的:观察单个视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)的聚集状态。方法:将猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)分为空白对照组(正常培养)、质粒转染组[转染VEGFR2-绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒]。采用共聚焦显微镜观察质粒转染组GFP的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中VEGFR2的mRNA和蛋白表达情况;单分子成像技术记录细胞膜上表达的单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和漂白步数,判断受体的寡聚或多聚状态。结果:共聚焦显微镜观察发现,转染12 h后,质粒转染组细胞可见GFP绿色荧光。qPCR检测结果显示,质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA表达较空白对照组显著升高,差异均有统计学意义(
t=11.240、12.330,
P<0.001、0.001)。Western blot检测结果显示,质粒转染组细胞VEGFR2蛋白表达较空白对照组增强,差异有统计学意义(
t=8.346,
P<0.01 )。单分子成像结果显示,无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2- GFP的荧光强度分布为双峰,其中单体、二聚体比例分别为86.0
作者:杨宋阳;张明亮;胡岚岚;王礼明;张晓敏;李筱荣
来源:中华眼底病杂志 2021 年 37卷 2期