目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP，构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒；根据人mda7基因序列，设计引物扩增mda7全长，并插入慢病毒载体pLVX-Puro，构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293 T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后，用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体，四质粒系统共转染293 T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293 T细胞的感染效率在90％以上，并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。 ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P＜0．05），mda7的表达水平远高于对照组（P＜0．05），且持续稳定表达至少1个月。 ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用，并对
作者：杨幼萍；丁燕；王继荣；曾玲晖；林红霞；朱杨丽；吴宏卫；王若燕；张建民；应荣彪
来源：浙江大学学报（医学版） 2014 年 2期
