目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5A-TP4反式激活相关基因,了解该基因的可能、生物学功能.方法:以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3.1(-)-TP4转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到63个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据.
作者：杨倩；成军；刘妍；王建军；洪源；党晓燕；纪冬；王春花；张树林
来源：中西医结合肝病杂志 2003 年 13卷 6期
