EF4是一个由lepA基因编码的与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,在细菌中高度保守,但其确切功能和分子机制尚不清楚,在结核分枝杆菌中的功能至今未见报道.为探索E F4在结核分枝杆菌中的功能,需构建一株结核分枝杆菌lepA基因敲除株.本研究以结核分枝杆菌H37Ra全基因组DNA为模板,设计并通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增lepA基因左、右臂,连接到p0004S质粒,构建同源重组质粒p0004S-ΔlepA.然后,通过噬菌体体外包装,将p0004S-ΔlepA质粒连接到phAE159质粒,构建phAE159-ΔlepA噬菌体包装质粒.在耻垢分枝杆菌mc2155中大量扩增噬菌体并受结核分枝杆菌侵染进行同源重组,筛选阳性克隆,从基因组和蛋白质表达水平检测该突变株中lepA基因及EF4蛋白表达.PCR结果显示,敲除株基因组中lepA基因已被潮霉素抗性基因成功替换,蛋白免疫印迹结果显示该敲除株中无EF4表达,表明其为成功构建的RaΔlepA.生长曲线分析显示,正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长趋势一致.敲除株与野生株在菌落形态上有一定差异,相比于野生株,R aΔlepA菌落颜色发黄,凸起偏厚,生长过程中生物膜皱褶较少.耐胁迫能力分析显示,与野生株相比,R aΔlepA耐热、抗去垢剂、抗氧化能力无显著差异,但耐酸性环境能力明显增强.本研究
作者：李明；陈润；葛文雪；姚梦依；张雪莲
来源：微生物与感染 2019 年 14卷 3期
