目的构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pET-23a(+),构建pET-ESAT-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3);PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白.结果从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT-6基因片段,成功构建重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别.结论利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础.
作者：温见翔；吴少庭；陈群；秦莉；袁仕善；林绮萍；雷明军；潘晖榕；张仁利；高世同；黄达娜
来源：中国热带医学 2004 年 4卷 6期
