通过RT-PCR方法克隆出人野生型负性共刺激分子B7-H4基因,将目的片段双酶切(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ)后,与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4-WT并进行鉴定;然后用定点突变法构建B7-H4核定位序列突变体基因,再构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4-NLS-MT;脂质体转染法将重组载体导入786-O细胞,CCK8法研究转基因细胞株的增殖率及对化疗药物5-氟尿嘧啶、阿霉素和顺铂的耐药性.结果显示:B7-H4野生型转基因细胞株相较于空白质粒组,可有效促进786-O细胞增殖,并赋予786-O细胞对3种化疗药物的耐药性.与空白质粒组相比,对5-氟尿嘧啶的耐药倍数为2.06,对阿霉素的耐药倍数为1.81,对顺铂的耐药倍数为1.72.机制研究显示B7-H4野生型可赋予肿瘤细胞抗凋亡作用,1.25 μg,/mL 5-氟尿嘧啶引起B7-H4 WT/786-O的细胞的凋亡率是20.2％,而Mock/786-O和B7-H4 NLS/MT/786-O细胞的凋亡率分别是41.1％和35.1％.说明B7-H4可能通过调控细胞凋亡赋予肿瘤细胞多药耐药性.当B7-H4核定位序列被突变后,这些功能都消失,说明B7-H4促肿瘤细胞增殖、赋予其多药耐药性的功能与其核定位序列密切相关.
作者：李金美；宋慧；练启慧；陈敏吉；章良；谢炜
来源：中国药科大学学报 2013 年 44卷 6期
